2015年4月18日 星期六

電子顯微鏡

一、電子顯微鏡的組成:




電子源:是一個釋放自由電子的陰極,一個環狀的陽極加速電子。陰極和陽極之間的電壓差必須非常高,一般在數千伏到3百萬伏之間。
電子透鏡:電子透鏡是電子顯微鏡鏡筒中最重要的部件,它用一個對稱於鏡筒軸線的空間電場或磁場使電子軌跡向軸線彎曲形成聚焦,其作用與玻璃凸透鏡使光束聚焦的作用相似,所以稱為電子透鏡。現代電子顯微鏡大多採用電磁透鏡,有時也有使用靜電透鏡,由很穩定的直流勵磁電流通過帶極靴的線圈產生的強磁場使電子聚焦,光學透鏡的焦點是固定的,而電子透鏡的焦點可以被調節,因此電子顯微鏡不像光學顯微鏡那樣有可以移動的透鏡系統。
真空裝置: 用以保障顯微鏡內的真空狀態,這樣電子在其路徑上不會被吸收 或偏向。
電子槍:是由鎢絲熱陰極、柵極和陰極構成的部件。它能發射並形成速度均勻的電子束,所以加速電壓        的穩定度要求不低於萬分之一。
樣品架:樣品可以穩定地放在樣本架上。此外往往還有可以用來改變樣品(如移動、轉動、加熱、降            溫、拉長等)的裝置。
探測器:來收集電子的信號或次級信號。


二、原理:
電子顯微鏡是根據電子光學原理,用電子束和電子透鏡代替光束和光學透鏡,,電子束透過樣品經過聚焦與放大後的物像,質的細微結構在非常高的放大倍數下成像的儀器。
分辨能力是電子顯微鏡的重要指標,它與透過樣品的電子束入射錐角和波長有關。可見光的波長約為300700奈米,而電子束的波長與加速電壓有關。當加速電壓為50100千伏時,電子束波長約為0.00530.0037奈米。由於電子束的波長遠遠小於可見光的波長,所以即使電子束的錐角僅為光學顯微鏡的1%,電子顯微鏡的分辨本領仍遠遠優於光學顯微鏡。  
三、種類與功能:
投射式電子顯微鏡: 投式電子顯微鏡因電子束穿透樣品後,再用電子透鏡成像放大而得名。它的光路與光學顯微鏡相仿。在這種電子顯微鏡中,圖像細節的對比度是由樣品的原子對電子束的散射形成的。樣品較薄或密度較低的部分,電子束散射較少,這樣就有較多的電子通過物鏡光欄,參與成像,在圖像中顯得較亮。反之,樣品中較厚或較密的部分,在圖像中則顯得較暗。如果樣品太厚或過密,則像的對比度就會惡化,甚至會因吸收電子束的能量而被損傷或破壞。
透射式電子顯微鏡: 透射式電子顯微鏡鏡筒的頂部是電子槍,電子由鎢絲熱陰極發射出、通過第一,第二兩個聚光鏡使電子束聚焦。電子束通過樣品後由物鏡成像於中間鏡上,再通過中間鏡和投影鏡逐級放大,成像於熒光屏或照相干版上。
中間鏡主要通過對勵磁電流的調節,放大倍數可從幾十倍續地變化到幾十萬倍;改變中間鏡的焦距,即可在同一樣品的微小部位上得到電子顯微像和電子衍射圖像。為了能研究較厚的金屬切片樣品,法國杜洛斯電子光學實驗室研製出加速電壓為3500千伏的超高壓電子顯微鏡。


掃描式電子顯微鏡: 掃描式電子顯微鏡的電子束不過樣品,僅在樣品表面掃描激發出次級電子。放在樣品旁的閃爍晶體接收這些次級電子,通過放大後調製顯像管的電子束強度,從而改變顯像管熒光屏上的亮度。顯像管的偏轉線圈與樣品表面上的電子束保持同步掃描,這樣顯像管的熒光屏就顯示出樣品表面的形貌圖像,這與工業電視機的工作原理相類似。
掃描式電子顯微鏡的解析度主要決定於樣品表面上電子束的直徑。放大倍數是顯像管上掃描幅度與樣品上掃描幅度之比,可從幾十倍續地變化到幾十萬倍掃描式電子顯微鏡的電子槍和聚光鏡與透射式電子顯微鏡的大致相同,但是為了使電子束更細,在聚光鏡下又增加了物鏡和消像散器,在物鏡內部還裝有兩組互相垂直的掃描線圈。物鏡下面的樣品室內裝有可以移動、轉動和傾斜的樣品台。

掃描式電鏡的主要特點是:①不需要很薄的樣品;②圖像有很強的立體感;③能利用電子束與物質相互作用而產生的次級電子,吸收電子和X射線等信息分析物質成分。




能量過濾透過式電子顯微鏡: 在能量過濾透過式電子顯微鏡中人們測量電子通過樣本時的速度改變。由此可以推測出樣本的化學組成,比如化學元素在樣本內的分佈。

四、電子顯微鏡的樣本處理:
在使用透視電子顯微鏡觀察生物樣品前樣品必須被預先處理。隨不同研究要求的需要科學家使用不同的處理方法。
固定為了盡量保存樣本的原樣使用戊二醛來硬化樣本和使用鋨酸來染色脂肪。
冷固定將樣本放在液態的乙烷中速凍,這樣水不會結晶,而形成非晶體的冰。這樣保存的樣品損壞比較小,但圖像的對比度非常低。
脫乾:用乙醇和丙酮來取代水。
墊入樣本被墊入后可以分割。
分割將樣本使用金剛石刃切成薄片
(100奈米內)
染色重的原子如鉛或鈾比輕的原子散射電子的能力高,因此可被用來提高對比度。
使用透視電子顯微鏡觀察金屬前樣本要被切成非常薄的薄片(約0.1毫米),然後使用電解擦亮繼續使得金屬變薄,最後在樣本中心往往形成一個洞,電子可以在這個洞附近穿過那裡非常薄的金屬。無法使用電解擦亮的金屬或不導電或導電性能不好的物質如硅等一般首先被用機械方式磨薄後用離子打擊的方法繼續加工。為防止不導電的樣品在掃描電子顯微鏡中積累靜電它們的表面必須覆蓋一層導電層。
五、電子顯微鏡的缺點:
       樣本必須在真空中觀察,因此無法觀察活樣本。在處理樣本時可能會產生樣本本來沒有的結構,這加劇了此後分析圖像的難度。由於投射電子顯微鏡只能觀察非常薄的樣本(100奈米內)可能物質表面的結構與物質內部的結構不同,且樣本製作不易,此外電子束可能通過碰撞和加熱破壞樣本。
六、重點整理與題目補充
電子顯微鏡
一、電子顯微鏡的原理有點像一個幻燈片投影機。投影機利用光線照射幻燈片,幻燈片上的圖案只容許部分光線通過。電子的透射程度取決於樣本的性質,這些性質包括密度、成份。例如:多孔的物料比高密度的物料更易讓電子通過。因此密度不均勻的樣本很適合利用這種方法來檢視。
二、何謂電子顯微鏡?
1.
電子源是一個釋放自由電子的陰極,一個環狀的陽極加速電子。陰極和陽極之間的電壓差必須非常高,一般在數千伏到3百萬伏之間。
2.
電子透鏡用來聚焦電子。一般使用的是磁透鏡,有時也有使用靜電透鏡的。電子透鏡的作用與光學顯微鏡中的光學透鏡的作用是一樣的。光學透鏡的焦點是固定的,而電子透鏡的焦點可以被調節,因此電子顯微鏡不像光學顯微鏡那樣有可以移動的透鏡系統。
3.
真空裝置。真空裝置用以保障顯微鏡內的真空狀態,這樣電子在其路徑上不會被吸收或偏向。
4.
樣品架。樣品可以穩定地放在樣本架上。此外往往還有可以用來改變樣品(如移動、轉動、加熱、降溫、拉長等)的裝置。
探測器,用來收集電子的信號或次級信號。
三、為什麼電子顯微鏡的放大倍率會較光學顯微鏡大呢?
物體比可見光的波長還要小時,光 學顯微鏡便無法使用。電子顯微鏡則利用高能量射出波長較短的電子波,因此放大倍率大大提高。
四、 電子顯微鏡的原理是甚麼?
電子顯微鏡以「電子束」,由「磁場」來作「透 鏡」來「折射」電子束。 電子於1897年由英國人J.J.Thomson發現,到量子力學的出現,提出電子波質二元論的理論,即電子既然 有粒子的特性,亦有波動的特性,所以電子亦應該有繞射現象
五、電子顯微鏡的使用須知
1.
試樣的厚度要小於1000
2.
影像觀察是要先投影於螢光幕上再觀察
3.
如果要調整焦點需調整物鏡之磁場強度
4.
目前的直接倍率可放大至50萬倍
5.
解像能約2
六、電子顯微鏡的主要組成部分是:
1.電子源是一個釋放自由電子的陰極,一個環狀的陽極加速電子。陰極和陽極之間的電壓差必須非常高,一般在數千伏到3百萬伏之間。
2.
電子透鏡用來聚焦電子。一般使用的是磁透鏡,有時也有使用靜電透鏡的。電子透鏡的作用與光學顯微鏡中的光學透鏡的作用是一樣的。光學透鏡的焦點是固定的,而電子透鏡的焦點可以被調節,因此電子顯微鏡不像光學顯微鏡那樣有可以移動的透鏡系統。
3.
真空裝置。真空裝置用以保障顯微鏡內的真空狀態,這樣電子在其路徑上不會被吸收或偏向。
4.
樣品架。樣品可以穩定地放在樣本架上。此外往往還有可以用來改變樣品(如移動、轉動、加熱、降溫、拉長等)的裝置。
2.
探測器,用來收集電子的信號或次級信號。
七、為什麼一般光學顯微鏡仍是生命科學領域重要的研究工具呢?
主要原因在於電子顯微鏡只能觀察經過冷凍切片處理的生物樣品。
換言之,樣品是死的。
八、電子顯微鏡分為以下哪幾種?
1.
透射電子顯微鏡
2.
能量過濾透過式電子顯微鏡
3.
場發射掃描電子顯微鏡
4.
掃描透射電子顯微鏡
九、為何電子顯微鏡可以看得比光學顯微鏡更小更細緻?
根據量子力學,運動中的粒子同時亦具有波動的特性。當電子被V伏特的電壓加速時,其波長λ與電壓的關係為:若電壓從100伏特變化至1000伏特,則電子波長從1.22埃變化至0.122埃。這些波長約比可見光要小1000倍。因此,電子顯微鏡可以比光學顯微鏡看到更小的物件。電子顯微鏡的加速電壓,約為50KV100KV左右,放大倍率可達230萬倍,若再利用照相放大則可達2百萬倍左右。
十、電子顯微鏡使用之電子槍種類可概分為那幾種?在應用上的特徵及優缺點分別為何?
鎢絲:亮度最小,價格便宜,電子能量散佈為3eV,解析度較差。 
LaB6
燈絲:亮度比鎢絲佳,價格中等,電子能量散佈為1.5eV,解析度中等。 
場發射式電子槍:亮度最佳,價格較高,電子能量散佈為0.3eV,解析度最好。
十一、Q:影響電子顯微鏡像能的像差種類為何?試說明其成因以及如何改善解像能之作法。
A:
繞射像差:降低電子束波長或提高透鏡品質(半張角)可降低繞射像差。
球面像差:降低電子束直徑或降低電子束半張角可降低球面像差。
散光像差:因透鏡磁場佈均勻所致,可利用像差調節器修正散光像差。
波長散佈像差:因高壓系統或透鏡電流不穩定所致,可提高加速電壓並使用FEG電子槍降低此像差。

十二、下列顯微鏡在生命科學領域重要的研究工具呢?
1.
光學顯微鏡
2.電子顯微鏡Ans.1
十三、最早製作出現電子顯微鏡的偉人是誰?
答:1931年恩斯特·魯斯卡和馬克斯·克諾爾研製了第一台透視電子顯微鏡。
十四、 試舉出電子顯微鏡的缺點?
1.
樣本必須在真空中觀察,因此無法觀察活樣本
2.
電子顯微鏡觀察到的樣本都是沒有顏色的
3.
電子顯微鏡購買和維護的價格都比光學顯微鏡高出許多
答:在電子顯微鏡中樣本必須在真空中觀察,因此無法觀察活樣本。在處理樣本時可能會產生樣本本來沒有的結構,這加劇了此後分析圖像的難度。由於透射電子顯微鏡只能觀察非常薄的樣本,而有可能物質表面的結構與物質內部的結構不同。
十五、從什麼時候開始,我們就可以用電子顯微鏡分辨原子?
A:1960年代 透射電子顯微鏡
十六、Q:當電子束與試片作用時,會產生哪些各種不同的訊號?
:如二次電子、背向散射電子、吸收電子、歐傑電子、特徵X...
十七、問題:下列關於電子顯微鏡的敘述何者錯誤?
選項:A.電子顯微鏡解析度較其它顯微鏡高的原因是電子的波長較
    可見光來的短。
   B.穿透式電子顯微鏡解析度較掃描式電子顯微鏡佳。
   C.掃描式電子顯微鏡由於是對物體表面進行掃描,因此能得
    到較立體的影像。
   D.若減少掃描式電子顯微鏡的工作距離則其解析度會下降。
答案:D 解析:D:會上升
十八、使用電子顯微鏡時樣本必須使用鋨酸做染色處理,請問鋨酸對哪一種物質做染色處理?
(A)
蛋白質
(B)
脂質
(C)
澱粉
(D)
礦物質
答案:(B)四氧化鋨的氧化性很強,所以能與未飽和碳﹣碳鍵反應,從而連接油脂。
十九、、 Q:電子顯微鏡的樣本處理有哪些?
A
:固定、冷固定、脫水、包埋、切片、染色
廿、 電子顯微鏡會依照使用要求改變觀察樣本的處理方式,請問當以保存樣本為優先時,應該選擇哪一種處理方式?
A.固定
B.
冷固定
C.
切片
D.
包埋
答案:B
冷固定是將樣本放在液態的乙烷中速凍的處理方式,這樣水分就不會結晶,而是形成非晶體的冰。對樣品的損壞比較小,但圖像的對比度會非常低,是以樣品保存為優先的處理方式
穿透式電子顯微
一、穿透式電子顯微主要分析的資訊,根據電子與物質作用所產生的方式包含以下三種
1.
擷取穿透樣品的直射電子或彈性散射電子成像
2.
電子繞射圖樣:用以分析樣品中微細組織以及晶體結構
3.
搭配 X光能譜分析儀或電子能量損失分析儀 作組成、鍵結等分析。
二、 Q:電子顯微鏡依據設計的原理與功能,可以概分為穿透式電子顯微鏡 及掃描式電子顯微鏡兩大類。而這兩大類又有何不同?
A:掃描式電子顯微鏡和穿透式電子顯微鏡一樣是利用電子束及電磁透 的設計,不同點在於,前者是電子束會在樣品表面進行掃描,掃描所得的電子訊號經過轉換成為畫素(pixel),進一步構成三維影像。後者是薄膜樣品上分佈著密度不一的物質,使得電子束穿透的程度不同。物質密度高的部份,電子束穿透得少,投射成較深的區塊;密度低的電子束穿透較多,則投射成較淺的區塊。所有深淺不同的區塊皆投射在螢光板上,再藉由螢光板的磷酸物質將電子束所產生的動能,轉化成為肉眼可見的二維影像。


三、下列何者"不是"穿透式電子顯微鏡(TEM)與其TEM分析的特點(多選題)?
(A)
基於電子束有限的穿透力,通常理想的觀察厚度在500-1000奈米之間
(B)試片製備的難度頗高,薄區有限
(C)在形象觀察方面, 對材料有敏銳的分析力
(D)在真空系統下利用電子槍產生之電子束通過一晶体薄膜,平行於入射線之晶面會產生繞射在繞射圖中繞射束與直接穿透電子束點間之距離剛好反比於某晶面間距,由不同之繞射圖形,可精確決定晶格常數及晶体格子結構,是研究材料內部結構很有利之工具。
(E)在有限厚度內的多層次結構具有透視能力,但是無法得到重疊影像
正確答案:(A)(E)
解析:(A)理想觀察厚度在500-1000""之間
(E)
不但具有透視能力,也可以得到重疊的影像
透射式電子顯微鏡
一、Q:透射式電子顯微鏡主要由哪四種構造組成?
A:
電子源,電磁透鏡系統,樣本架,成像系統

掃描式電子顯微鏡
一、是非題: 正確請打圈 錯誤請打叉並且訂正錯誤
掃描式電子顯微鏡的解析度大約為3.5~10nm, 而穿透式電子顯微鏡解析度約為0.2微米, 由此可證, 掃描式電子顯微鏡解析度較佳
正確解答:(X) 
訂正:掃描式電子顯微鏡的解析度大約為3.5~10nm, 而穿透式電子顯微鏡解析度約為0.2"nm", 所以, 掃描是電子顯微鏡解析度較差
二、掃描式穿梭電子顯微鏡的取像方式有那些?
A:(1)穩定電流取像法
設定的穿隧電流為回饋訊號,設定穿隧電流值即鎖定探針和樣品表面之間距。當探針在樣品表面掃描時,探針必須隨表面之起伏調整其高度;因此,以探針的高度變化來呈像,就反映出樣品表面的形貌。優點可容忍較大的表面高低變化;缺點是由於必須以回饋信號來調制,掃描速度較慢。
(2)
高度取像法
此法由於表面的高低變化,導致探針和樣品表面的間距時大時小,穿隧電流值也隨之改變。好處是可以快速掃描,缺點是高低起伏不能太大。
(3)
電流密度取像法
此法是結合了上述兩種方法。以定電流模式為架構,讓探針在回饋系統的控制下,在掃描過程中保持一定的探針/樣品間距。然後在每一點,瞬時切斷回饋作用,並利用這段期間,將偏壓在預定的範圍內調變,同時記錄不同偏壓所產生之穿隧電流。缺點是因為回饋系統必須不斷地開關,比較費時。


電子顯微鏡
一、電子顯微鏡也可觀察活體了!!
台大物理系副教授趙治宇成功研發出全球第一台可觀察小型活體細胞的「生物電子顯微鏡」,不但首度驗證水分子可用滲透的方式進出細胞膜,且與水共存的細胞膜,會自然形成一種介於液體和液晶之間的新物質狀態,為生物細胞和物理特性研究立下了新的里程碑。
他參考中研院院長李遠哲獲得諾貝爾獎的關鍵「動力真空」設計原理,成功在怕水的電子顯微鏡內加入利於活體觀察的水層,寫下全球第一次能用電子顯微鏡觀察活體切片的紀錄。
二、追加說明
固定:為了盡量保存樣本的原樣使用戊二醛來硬化樣本和使用鋨酸來染色脂肪
冷固定:將樣本放在液態的乙烷中速凍,這樣水不會結晶,而形成非晶體的冰。這樣保存的樣品損壞比較小,但圖像的對比度非常低
脫水:使用乙醇或丙酮來取代水
包埋:樣本被包埋於合成樹酯後進行切片
切片:將樣本使用金剛石刃或玻璃刀刃切成薄片
染色:重的原子如鉛或鈾比輕的原子散射電子的能力高,因此可被用來提高對比度
三、 問答題
為什麼實驗中,對組織照色藍光時,會產出綠光,而照射綠光會產生紅光?
A:
因為能階,藍光能量>綠光>紅光,當光照射到電子時,電子會往高軌域跳,然後經過一小段耗損,再放出一段比原先還要低能量的光